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酒石酸作为重要的化工和食品添加剂原料，具有L(+)和D(-)两种类型的对映体，是合成化学品和药物时重要的手性合成子和手性选择剂。传统上L(+)酒石酸是葡萄酒产业的副产品，其产量受到自然资源和季节的影响。微生物来源的顺式环氧琥珀酸水解酶（CESH）可用于制备高对映体纯度的手性酒石酸，是目前工业生产手性酒石酸的主要方法之一，于上世纪90年代实现产业化。虽然CESH是最早得到应用的工业酶之一，但其催化机制一直未能得到明确解析，从而阻碍了这类工业酶的理性改造与性能提升。解析CESH的催化机制对于这类工业酶的理性改造与性能提升具有重要意义。青岛能源所代谢物组学研究组对产L(+)和D(-)两类酒石酸的CESH[L]和CESH[D]进行了长期的研究，最近成功解析了CESH[L]的结构与催化机制，相关工作近期发表在生化领域期刊《Journal of Biological Chemistry》。
虽然催化相同的底物CES（顺式环氧琥珀酸），但CESH[L]和CESH[D]具有完全不同的序列、结构和催化机制，分别产生高对映体纯度的L(+)和D(-)酒石酸。在解析CESH[D]的结构与催化机制的基础上，研究团队经过多年努力又成功获得了两种CESH[L]的多种不同状态的晶体结构，包括不含底物的酶、与底物形成催化中间体的酶突变体、与产物形成复合物的酶突变体的高分辨晶体结构。结构分析表明，CESH [L]以高度特异的方式结合具有镜像对称结构的底物CES，通过Asp-His-Glu催化三联体实现两步催化水解，其中激活水分子的关键催化残基是一个Glu，而不是以往研究推测另一位置的Asp，发现并鉴定出负责为环氧乙烷上的氧原子提供质子以协助开环反应的氨基酸残基。这些结果完整地描绘了CESH[L]的立体催化机制，并完美地诠释了以往研究中的突变分析结果。高分辨结构的解析也为后续进一步开展CESH[L]理性改造以提升稳定性和催化性能奠定了基础。
在L(+)酒石酸生产中，通常使用全细胞催化剂或固定化方法来改善CESH[L]的稳定性。目前使用的全细胞催化剂均为胞内表达CESH[L]，细胞膜的通透性影响酶的催化效率和生产性能。代谢物组学研究组与北京科技大学宣劲松副教授课题组合作，成功开发了大肠杆菌细胞表面高效展示CESH[L]的技术。酶活测定结果表明，在大肠杆菌表面展示的CESH[L]酶总量超过了大肠杆菌胞内过表达所能达到的酶总量，不存在细胞通透性问题，同时能够多次重复使用，4摄氏度下可以长期保存且几乎不丧失活性。这一技术为提升L(+)酒石酸的工业生产效率提供了新的方案，相关技术申请了发明专利（202210273760.4），2024年4月9日得到授权。
图1.产L(+)-酒石酸的环氧化物水解酶的催化机制与细胞表面展示。
（A）CESH[L]催化中间体的晶体结构。（B）根据结构所推定的CESH[L]的催化机制。（C）大肠杆菌表面展示CESH[L]的全细胞催化剂示意图、稳定性与复用性。
相关研究由代谢物学研究组冯银刚研究员和崔球研究员、北京科技大学宣劲松副教授指导完成。研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、山东能源研究院以及北京科技大学相关项目的资助。（文/图 冯银刚）
相关论文和授权专利：
1. 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105635
Sheng Dong,Jinsong Xuan,Yingang Feng*,Qiu Cui* (2024) Deciphering the stereo-specific catalytic mechanisms of cis-epoxysuccinate hydrolases producing L(+)-tartaric acid. J. Biol. Chem. 300(2):105635.
2.冯银刚，宣劲松，周瑞，东升，崔球；顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系及构建和应用，中国发明专利ZL202210273760.4，2024年4月9日授权公告。
