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[2018.11.1]青岛能源所研究人员揭示微生物中一类转座元件的独特转录滑移机制

基因组中的转座元件是自然界中广泛存在的位置可变DNA序列,在基因组的稳定性、遗传变异和生物进化中具有重要作用。细菌基因组中的插入序列(Insertion sequence,IS)是常见和广泛存在的一种转座元件,根据其序列和作用的不同机制可以分成多个家族,目前已知有29个家族的插入序列,其中IS3是分布最为广泛的家族之一。目前,对插入序列作用机制的认知主要来自于对嗜中温微生物的研究,但是基因组表明嗜热微生物也包含有大量的插入序列,其转座机制尚未得到深入研究。嗜热微生物由于包含独特和高热稳定的酶类,具有特殊的研究和工业应用价值,在生物炼制中具有重要的作用。例如,热纤梭菌这一典型嗜热微生物,在木质纤维素工业生物炼制中极具应用前景。基于此,中科院青岛能源所代谢物组学研究组针对热纤梭菌等非模式微生物,前期开发了高效遗传操作平台,包括基于嗜热二类内含子的定向基因敲除工具和基于同源重组的无疤基因组编辑工具,并利用这些工具系统研究了热纤梭菌及其纤维小体对木质纤维素的高效降解机制。

在对热纤梭菌的基因组编辑工具开发的过程中,该课题组研究人员使用了腺苷激酶(Tdk)作为反筛标记,发现该反筛标记经常被一个非常活跃的IS3家族插入序列IS1447所失活。该课题组刘亚君副研究员等人对该插入序列进行了深入研究,通过基因组搜索和进化关系分析,发现IS1447类似的插入序列广泛存在于厚壁菌门的细菌中,在IS3家族的插入序列中具有非常独特的特征,代表了IS3家族中一个新的亚组。IS1447亚组通过+1位的转录滑移实现有功能的全长转座酶的合成,这是一种与已知的IS3家族所具有的的核糖体-1位翻译水平移码完全不同的移码方式,且这一转录滑移只需要连续的7个腺嘌呤核苷酸(A)即可实现,这也不同与目前公认的至少8个连续的A或T才能实现转录滑移机制。此外,多个纤维素降解菌的基因组中都含有数目非常多的IS1447亚组插入序列。上述研究表明IS1447代表了富含于厚壁菌门中的新的IS3亚组插入序列,丰富了人们对嗜热转座元件的认识,同时也为开发在嗜热微生物使用的基于插入序列的突变工具提供了基础。

上述工作最近发表在Biotechnology for Biofuels上,由青岛能源所冯银刚研究员和崔球研究员指导完成,青岛能源所刘亚君副研究员为论文的第一作者,该研究得到了科技部、国家自然科学基金委、山东省和中科院项目的支持。(文/图 刘亚君 冯银刚)

图1. 来源于热纤梭菌的IS1447序列及其转录滑移位点分析。IS1447可表达三种转座酶OrfA、OrfB及OrfAB,其中OrfAB为有功能的全长转座酶。紫色表示反向重复序列,绿色及红色分别表示转座酶翻译起始及终止位点,黄亮表示移码区域。

原文链接:

https://link.springer.com/article/10.1186/s13068-018-1304-8

Liu Y-J, Qi K, Zhang J, Chen C, Cui Q, Feng Y. Firmicutes-enriched IS1447 represents a group of IS3-family insertion sequences exhibiting unique + 1 transcriptional slippage. Biotechnology for Biofuels. 2018;11:300.

 

[2018.8.4]代谢物组学研究组在低成本小球藻培养技术研究中取得进展

小球藻是一种安全的单细胞藻类,富含蛋白质、必需氨基酸(EAAS)、维生素、矿物质、β-胡萝卜素、叶绿素等促进健康的物质。由于其蛋白质含量高,被视为理想的蛋白质来源,用作功能性食品、食品添加剂和医药产品的原料。

小球藻通常通过光合作用固定CO2而进行自养生长。然而,低生物量产量、占用大量土地是自养方式固有的缺点。与自养培养相比,异养体系更适合于产生高密度的细胞,从而积累大量的食品商品。

中科院青岛能源所代谢物组学研究组通过重离子辐照诱变和靶向筛选,获得高蛋白含量的小球藻突变体K05,并通过不同的生产方案评估了利用低成本甜高粱汁发酵培养小球藻生产营养添加化学品的稳定性、可扩展性和可持续性。这些结果对小球藻的功能性食品的优化开发具有重要意义。

上述研究获得了国家自然科学基金、海洋经济创新发展示范市项目等资助,并获得了兰州重离子加速器国家实验室和海南大学研究团队的支持。(文/图 宋晓金)

原文链接:

Song, Xiaojin, Wang, J., Wang, Y., Feng, Y., Cui, Q., Lu, Y., 2018. Artificial creation of Chlorella pyrenoidosa mutants for economic sustainable food production. Bioresource Technology 268, 340-345.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852418311015?via%3Dihub

[2018.7.9]科研进展:本团队成功解析产D(-)酒石酸的环氧化物水解酶催化机制

(研究所新闻http://www.qibebt.cas.cn/xwzx/tpxw/201807/t20180711_5041504.html

酒石酸具有L(+)和D(-)型对映体,是很多精细化学品和药物合成的手性前体元件。自然界中的酒石酸以L(+)型为主,而D(-)型酒石酸在自然界中较少存在,同时由于酒石酸是镜像对称的小分子量化合物,化学方法制备高对映体纯度酒石酸也比较困难。通过环氧化物水解酶等生物催化剂可以水解顺式环氧琥珀酸,高效制备高对映体纯度的酒石酸,其中产生L(+)和D(-)酒石酸的顺式环氧琥珀酸水解酶分别称为CESH[L]和CESH[D]。虽然在上世纪70年代就已经在自然界中发现了CESH[L]和CESH[D],并随后在工业化生产酒石酸中得到了应用,但由于缺乏这两种酶的晶体结构,它们的立体催化机制一直还不清楚。此外,环氧化物水解酶种类繁多,已有的研究表明可以通过分子改造实现对不同种类的环氧化物底物进行水解,从而可以用来制备多种手性化合物,在生物催化剂的开发中具有重要意义。

青岛能源所代谢物组学研究组研究人员在前期获得的CESH[D]高纯度表达纯化的基础上,通过与清华大学研究人员合作,成功解析了CESH[D]的高分辨晶体结构,并根据结构阐释了CESH[D]的立体催化机制,近期发表在Chem. Commun.上(https://doi.org/10.1039/C8CC04398A)。CESH[D]的结构表明,一个锌离子在底物结合中起到了关键作用,而周边残基通过大量的氢键作用使得催化残基和底物被精确固定,从而实现了高精度的立体催化,产生高对映体纯度的D(-)酒石酸。对CESH[D]的结构和催化机制的阐明,同时为基于这类酶进行新型生物催化剂设计开发提供了基础。

上述工作由青岛能源所冯银刚研究员、崔球研究员和清华大学王新泉教授合作指导完成,青岛能源所东升副研究员为论文的第一作者,该研究得到了国家自然科学基金委项目的支持。(文/图 冯银刚 东升)

图1 产D(-)酒石酸的顺式环氧琥珀酸水解酶CESH[D]的结构与催化机制。(A)CESH[D]的整体结构。(B)CESH[D]的活性位点结构及推测的底物结合模式。(C)根据结构分析推断的催化机制。

相关成果发表:

1.Sheng Dong, Xi Liu, Gu-Zhen Cui, Qiu Cui*, Xinquan Wang*, Yingang Feng* (2018) Structural insight into the catalytic mechanism of a cis-epoxysuccinate hydrolase producing enantiomerically pure D(-)-tartaric acid. Chem. Commun. DOI:10.1039/C8CC04398A. https://doi.org/10.1039/C8CC04398A

2.Gu-Zhen Cui, Shan Wang, Yifei Li, Yi-Jun Tian, Yingang Feng, Qiu Cui* (2012) High yield recombinant expression, characterization and homology modeling of two types of cis-epoxysuccinic acid hydrolases. Protein J. 31(5):432-438. http://dx.doi.org/10.1007/s10930-012-9418-5

3.Shan Wang, Gu-Zhen Cui, Xiang-Fei Song, Yingang Feng*, Qiu Cui* (2012) Efficiency and stability enhancement of cis-epoxysuccinic acid hydrolase by fusion with a carbohydrate binding module and immobilization onto cellulose. Appl. Biochem. Biotechnol. 168(3):708-717. http://dx.doi.org/10.1007/s12010-012-9811-8

[2018.5.2]代谢物组学研究组在被孢霉高产花生四烯酸研究中取得系列进展

花生四烯酸(Arachidonic acid, 简称ARA),属于ω-6系列的多不饱和脂肪酸,在体内发挥多种生物功能。因其功能的多样性,ARA已在保健食品、化妆品和医药等领域得到广泛应用。目前高山被孢霉已经成为工业生产ARA的最佳菌株,然而,产量低和成本高仍然是利用被孢霉大规模生产ARA的瓶颈。近年来,代谢物组学研究组基于在丝状真菌遗传改造方面的丰富经验,对具有自主知识产权的高山被孢霉菌株进行代谢工程改造,使之能高效生产ARA。

该团队开发了一个高效的被孢霉遗传操作平台,利用此平台在高山被孢霉中成功表达了外源VHb基因,并通过多次筛选得到了ARA高产菌株VHb-20。在限氧条件下,突变株油脂和ARA比对照株提高4倍和8倍,成功解决了高山被孢霉发酵中存在的溶氧限制问题(Zhang H., et al., 2017)。

研究团队还利用重离子诱变联合定向筛选的育种技术筛选出ARA高产菌株,ARA含量高达50%左右,达到国内领先水平。经过两轮诱变和筛选得到的突变体F-23,其油脂和ARA产量比原始菌株提高1.33和3.24倍。该工作近日发表于BMC biotechnology杂志上(Zhang H., et al., 2018)。

上述研究获得了国家自然科学基金、山东省重点研发项目等支持。(文/图 张慧丹 宋晓金)

图1. 诱变筛选流程图

 

原文链接:

Huidan Zhang, Yingang Feng, Qiu Cui*, Xiaojin Song*. Expression of Vitreoscilla hemoglobin enhances production of arachidonic acid and lipids in Mortierella alpina [J]. BMC biotechnology, 2017, 17(1): 68.

https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12896-017-0388-8

Huidan Zhang, Dong Lu, Xin Li, Yingang Feng, Qiu Cui, Xiaojin Song*. Heavy ion mutagenesis combined with triclosan screening provides a new strategy for improving the arachidonic acid yield in Mortierella alpina [J]. BMC biotechnology, 2018, 18(1): 23.

https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12896-018-0437-y

[2018.1.13]科研进展:本团队实现实现纤维小体原位关键酶的纯化及解析

(研究所新闻http://www.qibebt.cas.cn/xwzx/kyjz/201801/t20180123_4937307.html

纤维小体是细菌分泌的高效降解木质纤维素的多酶复合体,其高效降解机制及产纤维小体细菌的遗传改造是木质纤维素降解利用研究中的重要方向之一。热纤梭菌的Cel48S是其纤维小体的主要外切葡聚糖酶,是其纤维小体中含量最高的组分,在纤维素降解过程中起着关键作用。但是,Cel48S的内在性质使得对Cel48S的纯化存在很大的困难,文献中对该酶的性质鉴定报道存在很多相互矛盾之处,与该酶在纤维小体中的重要作用并不相符,这使人们难以深入揭示纤维小体的高效降解机制。青岛能源所代谢物组学团队崔球研究员、冯银刚研究员、刘亚君副研究员等基于前期开发的热纤梭菌遗传改造工具,通过对纤维小体的定向改造,实现了对其原位Cel48S催化结构域的高效纯化,从而成功的对Cel48S的酶学与结构性质进行了系统解析,揭示了Cel48S在纤维小体中的真正作用。相关成果已于2018年1月13日在线发表于Biotechnology for Biofuels (Liu YJ, et al, 2018, 11:6)。

木质纤维素水解糖化是实现木质纤维素生物质的高值利用的第一步,是国内外的研究热点。为了打破国外酶制剂技术垄断、突破糖化技术瓶颈,代谢物组学团队长期致力于开发基于热纤梭菌纤维小体的新型整合生物糖化技术路线。在这一路线框架下,需要通过对纤维小体这一多酶复合体的机制解析以及定向改良从而获得高效的全菌催化剂。为此,代谢物组学团队针对梭菌系统地开发了非模式微生物基因操作工具(J Microbiol Methods, 2012, 89: 201-8.; PloS One, 2013, 8:e69032; Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 313-23.),在热纤梭菌中实现了快速、准确的基因敲除、过表达和精准编辑,完成了对热线梭菌纤维小体脚架蛋白的功能贡献、解除纤维小体反馈抑制的定向改造(Biotechnol Biofuels, 2015, 8: 36; Biotechnol Biofuels 2017, 10: 124)等系列工作。同时,团队建立了成熟的X射线晶体学和生物大分子核磁共振等蛋白质结构解析平台,完成了多个纤维小体组分和工业酶催化机制的研究(J Struct Biol, 2014, 188: 188-193; Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 100: 2203–2212)。在完善的遗传操作平台和蛋白质结构解析平台的基础之上,研究人员对纤维小体关键组分Cel48S进行了更系统深入的研究。

作为热纤梭菌纤维小体中含量最高的的关键酶组分,Cel48S的酶学性质及结构特点一直受到广泛的关注。团队前期通过核磁共振方法修正了文献中关于Cel48S的组装模块的结构,对纤维小体的组装方式有了新的认识(J Struct Biol, 2014, 188: 188-193)。对于Cel48S的催化模块,由于难于异源表达,与纤维小体结合紧密难以从原位分离,文献中对其性质的报道相互矛盾,该酶在纤维小体中的真正作用并未得到有效阐明。为了解决这一问题,研究人员使用前期建立的热纤梭菌精准遗传操作工具,通过在Cel48S的催化结构域后面插入编码组氨酸标签和终止密码子的序列,实现了将Cel48S的催化结构域从纤维小体中分离并从培养物上清中的一步直接纯化。在此基础上,通过酶学测定和蛋白质结构分析,确定了天然Cel48S的高活性、结晶纤维素的底物偏好以及底物偶联的诱导契合效应,真正彻底阐明了纤维小体关键组分Cel48S的结构功能特性。同时,本研究提供了一个基于精准遗传操作实现分离纯化原位的纤维小体或其他分泌蛋白的方法,为进一步研究纤维小体木质纤维素降解机制及构建木质纤维素糖化的定向改良菌株提供了范例和基础。

相关系列研究得到了国家科技支撑计划、国家自然科学基金委员会以及山东省糖产业科学技术重点实验室联盟建设任务的资助。(文/图 刘亚君 冯银刚)

 

图1. 热纤梭菌Cel48S定向改造示意图(a)、Cel48S底物偏好性(b)及结构分析(c)

原文链接:

https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-1009-4

Liu, Y.-J., S. Liu, S. Dong, R. Li, Y. Feng and Q. Cui (2018). "Determination of the native features of the exoglucanase Cel48S from Clostridium thermocellum." Biotechnology for Biofuels 11(1):6.

 

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